Comparação de protocolos de extração de DNA para detectar Mycobacterium bovis em tecido bovino por PCR

Resumo

O atual comércio internacional de carne tem aumentado a pressão para haver um melhor e mais rápido diagnóstico de tuberculose bovina. O tradicional cultivo continua a ser o método padrão ouro para confirmar a infecção por Mycobacterium bovis, apesar de ser excessivamente demorado e necessitar de micobactérias viáveis. Métodos moleculares representam a superação de todos os defeitos dos métodos bacteriológicos com detecção e identificação mais rápidas. Entretanto, características das micobactérias, como uma complexa parede celular e a interação patógeno-hospedeiro, torna-os um desafio. Três protocolos de extração de DNA (A, B e C) foram testados em tecidos bovinos para verificar qual técnica é mais adequada para diagnóstico de rotina, avaliando sua especificidade e sensibilidade. Trinta lesões granulomatosas positivas no cultivo e 30 lesões granulomatosas negativas no cultivo foram utilizadas no experimento. A partir de cada amostra, três homogeneizados com diferentes diluições (10-1, 10-2 e 10-3) foram preparadas e submetidas à extração de DNA. A PCR para o gene alvo IS6110 foi realizada empregando-se dois volumes de DNA: um com 5 µL para todas as três diluições e outro com 2,5 µL da diluição 10-1. O Protocolo A foi capaz de detectar membros do complexo M. tuberculosis na maior parte das amostras. À medida que a diluição dos homogeneizados aumentou, a sensibilidade diminuiu. Embora o Protocolo A tenha apresentado a maior sensibilidade, seguido por C e B, este revelou a menor especificidade, que pode ser devido à insuficiência de organismos viáveis ou tempo de incubação no primo isolamento. Apesar de os métodos bacteriológicos clássicos ainda serem recomendados pela OIE, através da avaliação da sensibilidade dos protocolos de extração de DNA e dos procedimentos de PCR, concluímos que a melhor estratégia para a detecção de M. bovis é usar o Protocolo A em homogeneizados mais concentrados.