Comparação de diferentes protocolos para a detecção do vírus da diarréia viral bovina por RT-PCR em grupos de sangue total e de soro sangüíneo, artificialmente contaminados

Resumo

A técnica da RT-PCR foi otimizada e avaliada para a detecção da região 5’ terminal não-traduzida do genoma do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) em amostras clínicas de bovinos, constituídas por soro sangüíneo e sangue total, artificialmente contaminadas com a estirpe NADL do BVDV. Para a otimização da técnica foram avaliados: i) dois pares de primers, 103 / 372 (WEINSTOCK et al., 2001) e 324 / 326 (VILCEK et al., 1994) ii) quatro métodos de extração do ácido nucléico (fenol / clorofórmio / álcool isoamílico; sílica / isotiocianato de guanidina; uma combinação dos dois métodos anteriores e TRIzol™) e iii) diferentes concentrações e composições de reagentes, tampões e tempo/temperatura das reações. Entre todas as alternativas testadas a que resultou na amplificação de um produto com 290 pb, que foi facilmente visualizado em gel de agarose 2% com brometo de etídeo, foi a que empregou as seguintes condições: i) primers 103 e 372; ii) volume inicial e amostra clínica: 50 mL de soro sangüíneo; iii) extração do ácido nucléico: método da sílica / isotiocianato de guanidina, iv) transcrição reversa: 9 mL do ácido nucléico extraído, 1xPCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 e 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 60 unidades da enzima transcriptase reversa M-MLV, desnaturação do RNA a 97°C / 4 min e transcrição reversa a 42°C / 30 min e v) PCR: primers 103 / 372 com temperatura de anelamento de 59°C. A utilização da RT-PCR nas condições otimizadas nesse estudo possibilitou a amplificação da estirpe NADL do BVDV (103,56 TCID50) em pools, artificialmente contaminados, de soro sangüíneo de bovinos até a diluição de 1:160.