Comparação de protocolos de extração de DNA para detectar Mycobacterium bovis em tecido bovino por PCR

Autores

  • Cássia Yumi Ikuta Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
  • Daniella Carvalho Ribeiro Oliveira Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
  • Gisele Oliveira de Souza Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
  • Antonio Francisco de Souza Filho Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
  • José Henrique de Hildebrand Grisi-Filho Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
  • Marcos Bryan Heinemann Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
  • José Soares Ferreira Neto Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

DOI:

https://doi.org/10.5433/1679-0359.2016v37n5Supl2p3709

Palavras-chave:

Extração de DNA, Tecido bovino, Tuberculose bovina, Mycobacterium bovis, PCR.

Resumo

O atual comércio internacional de carne tem aumentado a pressão para haver um melhor e mais rápido diagnóstico de tuberculose bovina. O tradicional cultivo continua a ser o método padrão ouro para confirmar a infecção por Mycobacterium bovis, apesar de ser excessivamente demorado e necessitar de micobactérias viáveis. Métodos moleculares representam a superação de todos os defeitos dos métodos bacteriológicos com detecção e identificação mais rápidas. Entretanto, características das micobactérias, como uma complexa parede celular e a interação patógeno-hospedeiro, torna-os um desafio. Três protocolos de extração de DNA (A, B e C) foram testados em tecidos bovinos para verificar qual técnica é mais adequada para diagnóstico de rotina, avaliando sua especificidade e sensibilidade. Trinta lesões granulomatosas positivas no cultivo e 30 lesões granulomatosas negativas no cultivo foram utilizadas no experimento. A partir de cada amostra, três homogeneizados com diferentes diluições (10-1, 10-2 e 10-3) foram preparadas e submetidas à extração de DNA. A PCR para o gene alvo IS6110 foi realizada empregando-se dois volumes de DNA: um com 5 µL para todas as três diluições e outro com 2,5 µL da diluição 10-1. O Protocolo A foi capaz de detectar membros do complexo M. tuberculosis na maior parte das amostras. À medida que a diluição dos homogeneizados aumentou, a sensibilidade diminuiu. Embora o Protocolo A tenha apresentado a maior sensibilidade, seguido por C e B, este revelou a menor especificidade, que pode ser devido à insuficiência de organismos viáveis ou tempo de incubação no primo isolamento. Apesar de os métodos bacteriológicos clássicos ainda serem recomendados pela OIE, através da avaliação da sensibilidade dos protocolos de extração de DNA e dos procedimentos de PCR, concluímos que a melhor estratégia para a detecção de M. bovis é usar o Protocolo A em homogeneizados mais concentrados.

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Biografia do Autor

Cássia Yumi Ikuta, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Pesquisador, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, USP, São Paulo, SP, Brasil.

Daniella Carvalho Ribeiro Oliveira, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Pesquisador, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, USP, São Paulo, SP, Brasil.

Gisele Oliveira de Souza, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Pesquisador, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, USP, São Paulo, SP, Brasil.

Antonio Francisco de Souza Filho, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Discente, Curso de Doutorado do Epidemiologia Experimental aplicada às Zoonoses. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP, São Paulo, SP, Brasil.

José Henrique de Hildebrand Grisi-Filho, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Prof., Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP, São Paulo, SP, Brasil.

Marcos Bryan Heinemann, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Prof., Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP, São Paulo, SP, Brasil.

José Soares Ferreira Neto, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Prof., Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP, São Paulo, SP, Brasil.

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Publicado

2016-11-09

Como Citar

Ikuta, C. Y., Oliveira, D. C. R., Souza, G. O. de, Souza Filho, A. F. de, Grisi-Filho, J. H. de H., Heinemann, M. B., & Ferreira Neto, J. S. (2016). Comparação de protocolos de extração de DNA para detectar Mycobacterium bovis em tecido bovino por PCR. Semina: Ciências Agrárias, 37(5Supl2), 3709–3718. https://doi.org/10.5433/1679-0359.2016v37n5Supl2p3709

Edição

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