Confirmação da indução da hexaploidia do alotriploide “Híbrido de Timor” ‘CIFC 4106’ por contagem cromossômica

Abstract

As diversas estratégias empregadas para indução da duplicação cromossômica geram indivíduos com diferentes ploidias, inclusive mixoploides. Nesse sentido, é fundamental o uso de métodos que distinguem esses indivíduos. Dentre os métodos diretos, o único que inequivocamente confirma o nível de ploidia é a contagem cromossômica. Dessa forma, o presente trabalho tem por objetivo determinar o número cromossômico de alotriploides e hexaploides putativos oriundos da indução da duplicação cromossômica do alotriploide Híbrido de Timor (HT) ‘CIFC 4106’ (Coffea arabica x Coffea canephora). 48 plântulas foram regeneradas a partir de um novo procedimento, envolvendo calos embriogênicos friáveis tratados com colchicina (0,5; 1,5 ou 2,5 mM) por 96 h. A citometria de fluxo (CF) foi realizada a partir de fragmentos foliares dos indivíduos regenerados, pré-selecionando os alotriploides e os supostos hexaploides. Meristemas radiculares desses indivíduos foram tratados com 90 µM de ciclohexamida e 4 µM amiprofos-metil durante 1 h 45 min a 25ºC, e macerados em pool enzimático (celulase 4%, macerozime 1% e hemicelulase 0,4%) por 2 h a 34ºC. Em lâminas preparadas por dissociação celular e secagem ao ar, metáfases com 2n=3x=33 e com 2n=6x=66 cromossomos foram encontradas. A técnica empregada permitiu a obtenção de cromossomos bem espalhados na lâmina, garantindo uma contagem precisa do número de cromossomos. O procedimento citogenético foi primordial em virtude do elevado número de cromossomos, uma vez que, a técnica de esmagamento amplamente empregada, possivelmente resultaria em cromossomos sobrepostos. A CF possibilitou o screening de muitas plântulas em um curto período de tempo, mas a contagem cromossômica foi primordial para a determinação do nível de ploidia, uma vez que, pequenas alterações aneuploides podem não ser detectadas pelo citômetro de fluxo. Por se tratar de um experimento conduzido in vitro, a obtenção de cromossomos metafásicos é favorecida pela alta taxa proliferativa do material biológico, aliado a uma padronização refinada dos pré-tratamentos citogenéticos. O resultado da CF corroborou com a citogenética, permitindo avaliar o nível de ploidia a partir de diferentes tecidos, folhas e raízes, respectivamente. Dessa forma, a determinação do número de cromossomos deve ser parte indispensável do rigor experimental em experimentos de duplicação cromossômica.